蛋白聚集小体检测试剂盒

蛋白聚集小体检测试剂盒

PROTEOSTAT^® Aggresome detection kit

◆原理

聚集小体（Aggresome）是由一群不正常堆叠在一起的蛋白质所形成的包涵体（Inclusion Bodies）。聚集小体的出现往往也表明细胞正处于某种应激状态，比如高温、病毒感染、活性氧自由基攻击等。聚集体通常是响应细胞应激而形成，并通过分离错误折叠的蛋白质提供细胞保护机制，最终导致它们被自噬清除。此外，蛋白质聚集体的形成是多种人类疾病的标志，例如阿尔茨海默氏症、帕金森氏症、肌weisuo侧索硬化症或酒精性肝病。

PROTEOSTAT^® Aggresome detection kit中包含的 PROTEOSTAT^® 是一种分子转子染料，在溶液中沿着单个中心键的自由分子内旋转可防止荧光产生。当它特异地插入到错误折叠和聚集的蛋白中的交叉β-sheet四级结构中，旋转受到抑制并导致发出强烈的荧光。

PROTEOSTAT^® 聚集小体检测试剂盒提供了一种快速、特异、定量的方法来标记细胞中的聚集小体，且无需进行人工蛋白定点突变。PROTEOSTAT^® 染料已在广泛的条件下对多种小分子调节剂进行验证，适用于具有治疗价值的化学物的筛选。此外，本试剂盒还适用于多重免疫荧光，以在自噬和聚集体形成的背景下研究您的目标分子。

◆试剂盒组成

 ◆特点

●　提供基于细胞的灵敏的药物反应性测定，以在真实的细胞环境中识别与神经退行性疾病相关的抑制剂

●　可靠且简单的检测，不需要非生理性蛋白质突变或基因工程细胞系

●　作用条件广泛，适用于筛选具有潜在治疗价值的小分子化合物

●　已进行优化以兼容免疫染色

●　可通过流式细胞术轻松量化聚集体和相关包涵体

●　可用于神经退行性疾病、肝病、毒理学研究等的研究 

 ◆案例・应用

■　应用实例 1：流式细胞术检测聚集小体

流式细胞术的分析：Jurkat细胞在37°C下用 0.2% DMSO对照或用5 µM MG-132诱导过夜。处理后，将细胞固定并与PROTEOSTAT^® 染料一起孵育，无需洗涤即通过流式细胞术在FL3通道中使用488 nm激光进行分析。在 MG-132处理的细胞中，红色荧光信号增加约3倍。所描述的测定允许评估蛋白质聚集的影响。

■　应用实例 2：PROTEOSTAT^® 染料与荧光染料的应用

荧光显微镜：含有蛋白聚集体的HeLa细胞，用 5 µM MG-132蛋白酶体抑制剂（右）处理12小时，通过 PROTEOSTAT^®（红色）检测并用Hoechst 33342复染。左侧的为未经处理的对照。

荧光显微镜：含有蛋白聚集体的HeLa细胞，用 5μM MG-132蛋白酶体抑制剂处理12小时，通过PROTEOSTAT^®聚集体染料（左上）检测，显示与荧光素-p62抗体（右上）和复合图像（中下）的共定位

■　应用实例 3：不同搅拌速率对蛋白聚集的影响

使用本产品检测后，可知搅拌速度越快，蛋白聚集程度越大。

■　应用实例 4：蛋氨酸氧化可抑制蛋白聚集

蓝色曲线为对照，没有搅拌；在搅拌速度在300 rpm下， 绿色曲线与红色曲线分别表示蛋氨酸被氧化后的蛋白聚集情况。

使用本产品检测后，可知蛋氨酸被氧化后可抑制蛋白聚集。

■　应用实例 5 ：内质网应激相关细胞自噬产生蛋白聚集小体

分别25，50，75 mmCQ，100 nM的thapsigargin（TG）或5mM的MG-132处理K562细胞24小时。然后在温室下用PROTEOSTAT® （1：10,000）固定并透化细胞30min。接着在BD流式细胞仪LSR II的蓝色610/20 nm的通道分析细胞（30,000）。

图片来源：Courtesy of the Flow Cytometry Core Facility, Blizard Institute, Queen Mary University of London, London, UK.

■　应用实例 6

K562 细胞分别使用Thapsigargin (Tg, 0.1 µM)、25、50 和 75 µM lvkui (CQ) 用试剂处理以诱导内质网应激和不wanquan自噬 24 h。使用蛋白酶体抑制剂 MG-132 (5 µM) 作为阳性对照处理24 h。将沉淀的细胞固定并透化。然后，根据制造商的说明，使用 300 µL PROTEOSTAT^® 和 1 µg/mL DAPI（用于细胞周期测定）在室温下标记细胞30min。确定每个处理的S期的 Aggresome 倾向因子 (APF) 高于G1和高于S期的G2m的相对增加，并与对照值进行比较。与对照组相比，ER 应激诱导剂、Tg 和 50 µM CQ在S期比G1更能引起蛋白聚集体上调，但蛋白酶体抑制剂 MG-132 和 50 µM CQ 在 G2m 期比S期更显著地下调聚集体。

图片来源：Courtesy of the Flow Cytometry Core Facility, Blizard Institute, Queen Mary University of London, London, UK.